Resistenzbildung gegenüber antiretroviralen Substanzen in Ostafrika

Ziel dieses Forschungsvorhabens war es daher, eine sensitive und kostengünstige Methode für die Analyse von NNRTI-Mutationen zu entwickeln und zu etablieren. In Zusammenarbeit mit dem Robert-Koch-Institut (Abteilung P11 HIV-Variabilität und molekulare Epidemiologie unter der Leitung von Dr. Kücherer)  wurde die Pyrosequencing-Methode für die Bestimmung von NNRTI-Mutationen des für die Reverse Transkriptase codierenden Bereichs entwickelt. Die Methode wurde im HIV-Bereich bisher nur zur Analyse von Protease-Mutationen verwendet.

In unserem Forschungsvorhaben konnte die Pyrosequencing-Methode erfolgreich etabliert und optimiert werden, so dass NNRTI-Mutationen in der Reversen Transkriptase sicher detektiert werden können, sofern sie bei mindestens 10% der HI-Viren vorliegen. Aufgrund des langen A-Stretchs im Bereich der NNRTI Mutation K103N und der in diesem Bereich extrem hohen Sequenzdivergenz von HIV müssen die Codons 103, 106 und 108 in getrennten Untersuchungsansätzen auf das Vorliegen möglicher Mutationen analysiert werden. Für die Aminosäureregion 181 bis 190 hingegen ist eine Leselänge von 30 Basen möglich. Damit können die relevanten NNRTI-Mutationen an den Aminosäurepositionen 181, 188 und 190 der Reverse Transkriptase in einem Untersuchungsansatz analysiert werden, was weniger aufwändig und kostengünstiger ist. Der Nachweis, dass die entwickelte Methode tatsächlich in der Lage ist, NNRTI-Mutationen zu detektieren, wurde durch die parallele Analyse von identischen Proben mittels Pyrosequencing und konventioneller populationsbasierter Sequenzierung geführt. Damit kann die Pyrosequencing-Methode erfolgreich genutzt werden, um einzelne NNRTI-Mutationen preiswerter und mit einer höheren Sensitivität als konventionelle populationsbasierte Sequenzierungstechniken nachzuweisen.